БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЦЕТИЛИРОВАННОГО ТИМОЗИНА β4

^#Тел.: (495) 336-68-33; факс: + (495) 330-74-10; e-mail: [email protected]

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 ГСП, Москва В-437 ул. Миклухо-Маклая, 16/10

Поступила в редакцию 27.07.2010 г. Принята к печати 11.10.2010 г.

Тимозин β4 (43 а. о.) – высококонсервативный кислый пептид, регулирующий полимеризацию актина в клетках млекопитающих путем связывания с его глобулярной формой. Тимозин β4 проходит клинические испытания в качестве препарата для лечения трофических язв, ран и ожогов роговицы, а также острого инфаркта миокарда. В настоящее время тимозин β4 производят с помощью твердофазного химического синтеза. Биотехнологический синтез этого препарата осложнен тем, что существенный для взаимодействия с актином N-концевой аминокислотный остаток природного пептида ацетилирован. В данной работе мы предлагаем способ получения рекомбинантного предшественника тимозина β4 и его последующего направленного химического ацетилирования. Дезацетилтимозин β4 получали в составе гибридного белка с тиоредоксином и специфическим сайтом для расщепления протеиназой вируса гравировки табака (TEV-протеиназой). Была разработана следующая схема выделения дезацетилтимозина β4: (i) биосинтез растворимого гибридного белка (HP) в Escherichia coli; (ii) очистка HP с помощью ионообменной хроматографии; (iii) расщепление HP TEV-протеиназой; (iv) очистка дезацетилтимозина β4 от тиоредоксина с помощью ультрафильтрации. Ацетилирование аминогруппы N-концевого остатка Ser полученного пептида осуществляли добавлением уксусного ангидрида к раствору дезацетилтимозина β4 при pH 3.0. Выход реакции составил 55%. Окончательную очистку тимозина β4 производили с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Разработанный нами способ выделения рекомбинантного тимозина β4 является перспективным для масштабирования и позволяет получать для медицинского применения высокоочищенный препарат с выходом 20 мг с 1 л культуры.

Ключевые слова: тимозин β4, рекомбинантный, неферментативное ацетилирование; TEV-протеиназа.