БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНАЛОГОВ ГИРУДИНА-1 ИЗ Hirudo medicinalis

^#Тел.: +7 (495) 336-68-33; факс: +7 (495) 330-74-10; e-mail: [email protected]

Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, 117997 ГСП-7 Москва В-437 ул. Миклухо-Маклая, 16/10

Поступила в редакцию 13.07.2011 г. Принята к печати 18.07.2011 г.

Гирудин-1 – высокоселективный ингибитор тромбина, секретируемый слюнными железами медицинских пиявок Hirudo medicinalis. Этот антикоагулянт прямого действия используется для профилактики и лечения нарушений в системе свертывания крови. Помимо существующего рекомбинантного аналога гирудина-1 (63-десульфатогирудина-1, дезирудина), медицинское значение имеют его модифицированные аналоги, обладающие повышенной активностью и стабильностью. Полученные нами синтетические гены гирудина-1 и двух его аналогов ([Leu¹,Thr²]гирудина-1 и [Leu¹,Thr²]гирудина-1/3) были клонированы в экспрессирующий вектор pTWIN1 в одной рамке считывания с геном мини-интеина DnaB из Synechocystis sp. Штаммы-продуценты соответствующих гибридных белков были созданы на основе штамма E.coli ER2566. Разработаны схемы получения 63-десульфатогирудина-1 и его аналогов, включающие стадии выделения гибридного белка после разрушения клеточной биомассы штаммов-продуцентов, ренатурацию целевого пептида в составе гибридного белка, его рН-индуцируемое расщепление и хроматографическую очистку целевого продукта. С помощью стандартного амидолитического теста были определены антитромботические активности полученных пептидов. Разработанные способы получения 63-десульфатогирудина-1, [Leu¹,Thr²]-63-десульфатогирудина-1 и [Leu¹,Thr²]-63-десульфатогирудина-1/3 позволили получить эти пептиды с высоким выходом (14, 25 и 24 мг с 1 л клеточной культуры, соответственно) и высокой активностью 13423, 33333 и 19802 ATU/мг, соответственно.

Ключевые слова: 63-десульфатогирудин-1; интеин; антитромботическая активность.