ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИЗОТОПНЫЙ ОБМЕН ВОДОРОДА НА ДЕЙТЕРИЙ И ТРИТИЙ В ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОМ ИНСУЛИНЕ ЧЕЛОВЕКА

© 2013 г. Ю. А. Золотарев¹*^,#, А. К. Дадаян¹*, В. С. Козик¹*, Е. В. Гасанов¹*, И. В. Назимов²*, Р. Х. Зиганшин²*, Б. В. Васьковский²*, А. Н. Мурашов³*, А. Л. Ксенофонтов⁴*, О. Н. Харыбин⁵*, Е. Н. Николаев⁶*, Н. Ф. Мясоедов¹*

^#Тел.: +7 (495) 196-02-13; факс: +7(495) 196-02-21; e-mail: [email protected]

¹*Институт молекулярной генетики РАН, 123182, Москва, пл. Курчатова, 2;
²*ФГБУН Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН;
³*Филиал ФГБУН Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН;
⁴*Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им М.В. Ломоносова;
⁵*Институт биомедицинской химии РАМН;
⁶*Институт биохимической физики РАН

Поступила в редакцию 10.04.2013 г. Принята к печати 22.04.2013 г.

Исследована реакция высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена, происходящая в пептидах и белках под действием активированного на катализаторе спилловер-водорода. Реакция человеческого генно-инженерного инсулина с дейтерием и тритием при 120–140^оС привела к включению 2–6 изотопных атомов водорода на молекулу. Для определения распределения изотопной метки по аминокислотным остаткам меченного тритием инсулина провели окисление S-S-связей в инсулине надмуравьиной кислотой, выделили полипептидные цепи, после чего провели их кислотный гидролиз, аминокислотный анализ и жидкостный сцинтилляционный счет трития в аминокислотах. Показано, что изотопная метка включается во все аминокислотные остатки белка, при этом наибольшее включение наблюдается в пептидный фрагмент FVNQHLCGSHLVE (B1–13) B-цепи инсулина, а остатки His5 и His10 этого фрагмента содержат около 45% всей изотопной метки белка. Для анализа распределения изотопной метки в пептидных фрагментах меченого инсулина использовали также восстановление S-S-связей 2-меркаптоэтанолом, ферментативный гидролиз глутамилэндопептидазой из Bacillus intermedius и разделение полученных пептидов с помощью ВЭЖХ. С помощью масс-спектрометрии идентифицированы пептидные фрагменты, образующиеся за счет гидролиза по связи Glu-Хaa в B-цепи. Масс-спектроскопический анализ изотопомерного состава образцов меченного дейтерием инсулина показал, что все молекулы белка участвуют в реакции твердофазного изотопного обмена водорода в равной мере. Меченный тритием инсулина полностью сохраняет физиологическую активность.

Ключевые слова: инсулин, мечение тритием и дейтерием; твердофазные реакции изотопного обмена; масс спектроскопия.

Биоорг. химия 2014, 40 (1): 31-41