ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОПЕПТИДОВ ЛИТИЧЕСКИХ ЭНДОПЕПТИДАЗ AlpA И AlpB Lysobacter sp. ХL1 МЕТОДОМ СЭНДВИЧ-ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

© 2014 г. Н. В. Руденко*^, ***^{, #}, И. М. Цфасман**, О. Р. Латыпов**, Л. А. Ледова**, Л. А. Красовская**, А. П. Каратовская*^, ***, Ф. А. Бровко*^, ***, Н. В. Васильева**, О. А. Степная**

^#Тел.: +7 (4967) 73-37-46; e-mail: [email protected]

*Филиал ФГБУН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290, Пущино, проспект Науки, 6
**ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 142290, Пущино проспект Науки, 5
***Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино, проспект Науки, 3

Поступила в редакцию 24.07.2013 г. Принята к печати 29.10.2013 г.

Внеклеточные литические эндопептидазы AlpA и AlpB грамотрицательной бактерии Lysobacter sp. ХL1 имеют высокую степень гомологии и синтезируются в виде препробелков, состоящих из сигнального пептида, пропептида и зрелой части. В данной работе получено два моноклональных антитела против пропептида эндопептидазы AlpA (ProA) и одиннадцать против пропептида эндопептидазы AlpB (ProB). Константы аффинности для антител к ProA составляли 2.9 х 10⁹ и 3.5 х 10⁹ М^-1, а для антител к ProB – от 1.5 х 10⁸ до 2.2 х 10⁹ М^-1. Полученные антитела не обладали иммуноперекрестной реактивностью между собой, а также со зрелыми формами ферментов. На основе моноклональных антител разработан сэндвич-иммуноферментный анализ, позволяющий количественно определять эти пропептиды в растворенной нативной форме. Линейный диапазон определения ProA составил 1.5–100.0 нг/мл с ошибкой измерения 6%, а для определения ProB – 0.2–6.25 нг/мл с ошибкой 6%. С помощью разработанного метода выявлены пропептиды ProA и ProB в лизате клеток Lysobacter sp. ХL1 в количестве 1.18 ± 0.03 и 0.096 ± 0.002 нг на 1 ОЕ540 бактериальной культуры соответственно. Иммунохимический метод определения разных форм литических эндопептидаз AlpA и AlpB может быть полезен при решении вопросов, связанных с их секрецией в окружающую среду.

Ключевые слова: Lysobacter, эндопептидазы, секреция белков, моноклональные антитела, сэндвич-иммуноферментный анализ.

Биоорг. химия 2014, 40 (3): 297-304