МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ АФФИННО-ОЧИЩЕННЫХ ПРОТЕАСОМ ИЗ КЛЕТОК МИЕЛОГЕННОЙ ЛЕЙКЕМИИ ЧЕЛОВЕКА ЛИНИИ К562

© 2014 г. Т. О. Артамонова*, М. А. Ходорковский*, А. С. Цимоха**^{, #}

^#Тел.: +7 (812) 297-37-40, факс: +7(812) 297-03-41; e-mail: [email protected]

*ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский Государственный Политехнический Университет;
**ФГБУН Институт цитологии РАН, 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4

Поступила в редакцию 19.05.2014 г. Принята к печати 11.06.2014 г.

Протеасомы осуществляют регулируемый протеолиз большинства белков в клетке и тем самым играют ключевую роль в регуляции различных клеточных процессов. Одним из важных этапов в понимании функций протеасом в клетке и механизмов их регуляции является определение субъединичного состава и посттрансляционных модификаций протеасом. Для решения этой задачи на примере клеток миелогенной лейкемии человека использована стратегия аффинной очистки протеасом с последующим масс-спектрометрическим анализом. Протеасомы очищали из стабильной клеточной линии К562, экспрессирующей субъединицу β7 (PSMB4) 20S протеасомы, меченную по С-концу HTBH_пептидом, включающим два фрагмента His6, специфический сайт расщепления Tobacco Etch Virus (TEV)-протеазой и сигнальную последовательность для биотинилирования in vivo, методом нековалентного связывания – через образование комплекса биотина со стрептавидином с последующей элюцией посредством TEV-протеазы. С помощью MALDI-ICR-масс-спектрометрии идентифицированы все субъединицы 26S протеасомы, а также регуляторы PA200 и PA28γ. Показано, что с протеасомами ассоциированы белки теплового шока, компоненты убиквитин-протеасомной системы и некоторые белки цитоскелета. Выявлен ряд новых сайтов фосфорилирования, убиквитинилирования и N-концевые модификации у 16 субъединиц протеасом. Представленный масс-спектрометрический анализ будет крайне полезен для дальнейших протеомных исследований протеасом при клеточном стрессе.

Ключевые слова: аффинная очистка, масс-спектрометрия, протеасома, клетки миелогенной лейкемии человека, убиквитин-протеасомная система, убиквитинилирование, фосфорилирование

Биоорг. химия 2014, 40 (6): 720-734