БИМОЛЕКУЛЯРНАЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ КОМПЛЕМЕНТАЦИЯ НА ОСНОВЕ КРАСНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА FUSIONRED

© 2016 г. Л. А. Кост*^, **, Е. В. Путинцева*, А. Р. Переверзева*, Д. М. Чудаков*^, **, К. А. Лукьянов *^, ***, А. М. Богданов*^, ***^{, #}

^#Тел.: +7 (499) 724-81-22, эл. почта: [email protected]

*Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
**Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова, 117997, Москва, ул. Островитянова, 1
***Нижегородская государственная медицинская академия, 603005, Нижний Новгород, пл. Минина, 10/1

Поступила в редакцию 21.03.2016 г. Принята к печати 10.05.2016 г.

Цель работы – создание “сплит”-вариантов красного флуоресцентного белка FusionRed, каждый из которых состоит из двух раздельных полипептидов, нефлуоресцентных частей белка FusionRed, а их комплекс при созревании формирует функциональный флуоресцентный белок. На первом этапе работы созданы различные варианты белка FusionRed, пермутированные по кругу (в круговых пермутантах полипептидную цепь белка делят на две части, которые меняют друг с другом местами, так что N-концевой фрагмент идет после С-концевого). Были тестированы 23 точки пермутации, из которых выбраны два варианта с наибольшей скоростью созревания хромофора (появления флуоресценции). Эти белки, названные cpFR76-73 и cpFR189-188 (первое число соответствует номеру последнего аминокислотного остатка N-концевого фрагмента, второе число – номеру первого аминокислотного остатка С-концевого фрагмента), были спектрально схожи с FusionRed, но обладали несколько сниженным квантовым выходом флуоресценции. Далее мы получили и протестировали сплит-белки FR76-73 и FR189-188, соответствующие данным пермутированным вариантам, в клетках млекопитающих. Для ассоциации разделенных N- и С-фрагментов FusionRed были использованы гетеродимеризующиеся “лейциновые молнии”. Было показано, что сплит-вариант FR189-188 созревает при 37°С и обладает яркостью флуоресценции, не уступающей таковой исходного белка FusionRed. Таким образом, FR189-188 потенциально применим для широкого круга задач, например, для выявления взаимодействий двух целевых белков или определения популяций клеток, в которых одновременно активны два изучаемых генных промотора.

Ключевые слова: красный флуоресцентный белок, сплит-белок, FusionRed, белок-белковые взаимодействия, флуоресцентная микроскопия.

Биоорг. химия 2016, 42 (6): 683-688