MILDEW RESISTANCE LOCUS O GENE CLONING, CHARACTERIZATION, AND EXPRESSION PATTERN IN MULBERRY (Morus multicaulis) AND ITS PROKARYOTIC EXPRESSION IN E. coli ¹⁾

*E-mail: [email protected]; [email protected] (Long Li; Weiguo Zhao)

¹School of Biology and Technology, Jiangsu University of Science and Technology, Zhenjiang Jiangsu, 212018 PR China;
²Sericultural Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei Anhui, 230061 PR China;
³Sericultural Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhenjiang Jiangsu, 212018 PR China

Принята к печати 19.06.2017 Поступила в редакцию 27.02.2017

DOI: 10.7868/S0132342318010104

Клонирование, характеристика и паттерн экспрессии гена устойчивости к плесени локуса О шелковицы (Morus multicaulis) и его экспрессия в прокариотической системе E. coli. Локус устойчивости к плесени О (MLO, от англ. mildew resistance locus O), который кодирует семиспиральный трансмембранный белок, считается модельным геном растений для изучения устойчивости широкого спектра. Он является отрицательным регулятором устойчивости к плесени и, таким образом, потенциально может использоваться в селекции растений. В данной работе полная последовательность кДНК, кодирующая ген MLO листьев шелковицы (Morus multicaulis), была клонирована с помощью экспрессируемых маркерных последовательностей (EST, от англ. expressed sequence tags) шелковицы, технологии гомологичного клонирования и метода быстрой амплификации 5'-концов кДНК c помощью РНК-лигазы (5'-RLM-RACE, от англ. RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends) и ОТ-ПЦР; последовательность была названа MMLO и депонирована в базу данных GenBank под номером KX683296. Длина полной кДНК составила 1943 п.о., включая 5'-нетранслируемую область (5'-UTR) длиной 106 п.о. и 3'- нетранслируемую область (3'-UTR) длиной 160 п.о., а также открытую рамку считывания (ORF) длиной 1677 п.о., кодирующую белок из 558 аминокислот. Расчетная молекулярная масса и изоэлектрическая точка (pI) предполагаемого белка 62.48 кДа и 9.03, соотв. Белок MMLO имеет в своем составе домен Mlo и принадлежит к суперсемейству Mlo. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей, кодируемых генами MLO разных видов, показал высокую степень родства между шелковицей и Eucalyptus grandis, Ziziphus jujube и Juglans regia. Количественная ПЦР в реальном времени показала, что MMLO экспрессируется во всех исследованных тканях, включая листья, почки, плоды, побеги, флоэму и ксилему шелковицы; при этом наивысший уровень экспрессии наблюдался во флоэме. Уровень экспрессии мРНК увеличивался и значительно менялся в условиях засухи, холода и солевого стресса по сравнению с нормальной ростовой средой. Рекомбинантная экспрессионная плазмида была получена путем вставки сегмента MMLO, соответствующего открытой рамке считывания, в экспрессионную плазмиду pET-28a(+). По данным электрофореза в денатурирующих условиях фьюжн-белок успешно экспрессировался. В целом результаты способствуют лучшему пониманию молекулярных основ передачи сигнала в условиях стрессовых реакций у шелковицы.

Ключевые слова: шелковица, локус устойчивости к плесени О, mildew resistance locus O (MLO), клонирование, характеристика, паттерн экспрессии, прокариотическая система экспрессии.
________________________
¹⁾ Полный текст статьи печатается в английской версии

Биоорг. химия 2018, 44 (1): 102-102